QTG策略的研究步骤

候选基因定位：
通过玉米自交系HZS和1462，构建F₂分离群体，混池测序，使用LOD阈值3.7，检测了位于染色体1、3、6和7上的4个QTL，分别解释了总表型方差的11.22%、7.49%、9.39%和16.60%。衍生F2:3家系的分析，验证了4个QTL位点的可靠性。同时，选择LOD值最高的QTL(在F₂群体中为11.99)，位于7号染色体上(以下简称qPH7)，采用QTG-seq策略进行精细等位。使用12个分子标记，筛选出813个在qPH7处为杂合子，在其他QTL处为纯合子的BC1F1个体。选择15株，自交，构建BC1F1:2家系，表型分析进行极端混池构建，混池测序（>280×）检测到197,021个高质量SNP位点。smooth LOD及ED⁴分析7号染色体上只有一个峰，位置在135,216,475 bp处，属于Zm00001d020874基因区域，其编码一个含有NF-YC-结构域的蛋白，其拟南芥同源物已被报道影响开花时间。ED分析表明，qPH7候选基因位于峰值位置周围的300-kb区间，该区间包含13个基因，也包括Zm00001d020874基因。

qPH7的精细定位和候选基因挖掘

候选基因验证：
使用RNA-seq，评估两个亲本中300-kb区间内的任何候选基因是否存在表达的显著差异。在茎顶端分生组织(SAM)和节间分生组织中，Zm00001d020874的表达量均具有显著的差异。根据其拟南芥同系物在控制开花时间方面的已知功能和由smoothLOD算法识别出的强精细定位信号，我们认为Zm00001d020874是qPH7的强候选信号。为了核实Zm00001d020874在qPH7位点上的功能，构建了一个由RNA指导的CRISPR-Cas9表达载体，以Zm00001d020874外显子上的两个区域为目标，对野生型玉米自交系CAL1进行转化，获得两棵转基因阳性植株T13和T16。转基因植株株高显著低于对照组，支持Zm00001d020874是qPH7功能基因的假设。对亲本HZS和1462中的Zm00001d020874序列分析发现6个变异位点，对181个从Chinese association mapping panel上获得的自交系进行RNA测序分析，表明3个基因型之间Zm00001d020874的表达量存在显著差异，且植株高度和Zm00001d020874的表达量存在显著相关性。类似的现象在穗高和发育时间参数—花粉脱落日、吐丝日和抽穗日等性状上发现，表明Zm00001d020874基因在株高上的影响可能与生殖发育有关。选择足迹分析揭示Zm00001d020874在玉米改良过程中受到选择

候选基因的验证
 

研究意义：
QTG-seq只需要4代就可以达到基因的精细定位，其速度可与质量性状的基因相媲美。因此，与其他方法相比，QTG-seq是一种更强大的快速QTL精细定位的方法。


参考文献:
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