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文献解读丨纳米孔测序自适应采样在疟原虫检测中的应用
疟疾是由疟原虫属寄生虫引发的一种感染性疾病，截至2021年，全球疟疾患者总数已达2.47亿。为探究疟原虫耐药基因突变及寄生虫种群动态，科研人员通常需要对患者血液样本进行全基因组测序。然而，血液DNA中人类基因占据较大比例，因此需对疟原虫基因组进行富集，以便进行检测。Oxford Nanopore Technologies（ONT）的自适应采样功能恰好可以解决此问题，可以实现在测序过程中直接富集疟原虫基因组的序列。
Kris Laukens团队对纳米孔自适应采样技术在未进行疟原虫基因组富集的血液DNA中对疟原虫序列富集的潜力进行了评估。研究结果显示，在对模拟样本进行测序时，疟原虫参考基因组的覆盖率可达97%，并检测到33个耐药基因，与Sanger测序得到的结果高度一致。初步推断ONT自适应采样可以应用于疟原虫感染检测。
文章标题：纳米孔自适应采样法直接从血液样本中对疟原虫进行选择性全基因组测序
发表时间：2023年12月03日
发表期刊：mBio
IF：7.786
绝大多数疟疾是由疟原虫引起的。因疟疾对人类健康带来较大威胁，对疟原虫的种群动态和抗药性进行深入研究具有重要意义。然而，从患者血液样本中提取足够量的寄生虫DNA以满足全基因组测序（WGS）的需求，具有极大挑战。ONT公司的测序仪自适应采样功能为减少疟疾患者血液样本中的人源核酸的干扰提供了新的解决方案。这一技术能够识别并分析正在测序的DNA链，当遇到非目标reads，可以通过反转电流方向将非目标片段“退出”，从而实现对目标reads的富集。
图1 实验方案
本研究采用稀释法构建了八组模拟样本，以比较常规测序和自适应采样测序在人类和疟原虫测序数据中的reads数、数据量和富集程度方面的差异。这八组模拟样本的设计涵盖了从0.1%疟原虫和99.9%人类DNA到84.3%疟原虫和15.7%人类DNA的比例范围（由于疟原虫血液培养中的人源基因组难以完全去除，导致基因组纯度无法达到100%）。此外，还将对三名疟原虫感染患者的血液样本进行自适应采样测序，以评估自适应采样在临床样本测序中的应用潜力。
图2 自适应采样时对疟原虫基因组富集程度及变化程度
在含有0.1%-8.4%疟原虫DNA的样本中，应用自适应采样技术能够使疟原虫序列的富集程度提高三至五倍（图2a）。此外，采用自适应采样进行测序后，测序结果中疟原虫基因组数据量显著增加（图2b）。
表1 临床样本测序覆盖率、深度、疟原虫测序reads数和碱基的百分比以及获得的估计倍数富集
人类与疟原虫基因组测序的分析结果显示在三个患者样本中，人源序列占据大部分，仅0.2%至9.7%的reads属于疟原虫。而在同一患者样本中，疟原虫基因组的数据量差异较大，范围从1.7%到42.5%不等）；并且可发现通过自适应采样进行序列富集，患者血液样本中疟原虫基因组的富集程度得以显著提高（表1）。
表2 三例疟原虫患者样本中33种耐药基因与Sanger测序的一致性
经纳米孔测序与Sanger测序所得结果表明，样本1测序结果的一致性达到了97%，而样本2与样本3测序结果的一致性则达到了100%（表2）。
图3 各种富集方式需要的时间比较（E：DNA提取。L：文库制备）
图4 样本3片段长度分布图及选择性全基因组扩增扩增后片段长度分布图
针对选择性全基因组扩增法、去宿主法以及ONT自适应采样法进行对比分析：去宿主法仅限于使用新鲜全血样本，而其他两种方法则可适用于冷冻血液或干血点（图3左侧）；在进行文库制备前，选择性全基因组扩增测序需要历经长达17小时的扩增步骤，杂交捕获亦需66小时的捕获时间，相较之下，去宿主法的前期准备时间较为短暂，但也需进行层析柱过滤3小时或滤膜过滤30分钟，而自适应采样法无需前期富集步骤，在基因组提取后便可直接建立文库。因此，在前期准备环节中，自适应采样法消耗的时间相对较短。同时，全基因组测序法可能引入扩增偏差，并限制可获得的片段大小（图4）。
图5 样本3的每条染色体的测序深度图
采用纳米孔自适应采样（红色）或选择性全基因组扩增（蓝色）对疟原虫DNA进行富集，随后以正常模式进行纳米孔测序。根据染色体深度图可以看出Nanopore自适应采样与选择性全基因组扩增相比表现出更高的一致性（图5）。
纳米孔测序由于其便携性和易用性，是一种很有前景的疟疾样本现场测序方法。在本研究中，研究者探讨了在MinION设备上对未富集的样本进行测序时，使用自适应采样来富集疟原虫序列的可行性。可以证明：
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对于含有0.1%-8.4%疟原虫DNA的基准样品，可以实现三到五倍的富集；通过对寄生虫血症水平在0.09%至0.60%之间的三份患者的临床血液样本进行测序，可以观察到不同程度的的富集水平（3.9倍、5.8倍和2.7倍）；在自适应采样模式下对患者样本进行测序，得到的reads足以覆盖疟原虫参考基因组的至少97%，平均深度为5至355；耐药基因检测结果，与Sanger测序进行比较时，表现出高度一致性；与依赖于富集的WGS方法相比，ONT自适应采样纳米孔测序方法更具优势。
纳米孔测序的因其独特的测序原理，可以实现无偏好性的真实反应样本丰度及可偏向性富集特定物种序列，除此之外纳米孔测序自适应采样可以达到测序快速、灵活且无扩增偏差等优点，在寄生虫检测领域十分具有潜力。
参考文献：
[1]De Meulenaere K, Cuypers W L, Gauglitz J M, et al. Selective whole-genome sequencing of Plasmodium parasites directly from blood samples by Nanopore adaptive sampling[J]. mBio, 2023: e01967-23.
