近日，山东农业大学动物分子遗传与生物技术研究室姜运良教授团队以“Identification of genes involved in chicken follicle selection by ONT sequencing on granulosa cells”为题的研究论文在期刊“Frontiers in Genetics”上在线发表，该研究采用Nanopore测序技术解析了等级前卵泡（Pre-GCs）和分层卵泡（Post-GCs）中颗粒细胞的转录组图谱，鉴定出了鸡卵泡选择的候选基因，龙8总区基因在该研究中承担了Nanopore全长转录组测序及分析工作。

性成熟的鸡卵巢中存在不同大小的卵泡，大致可分为Pre-GCs和Post-GCs。在产蛋期间，卵巢约每天一次从一群黄色小卵泡（SYF）中招募卵泡进入排卵前层级，这一过程被称为卵泡选择。卵泡的选择决定了卵泡的等级顺序，是影响蛋鸡产蛋性能的重要步骤。鸡中，卵泡选择前后颗粒细胞的形态和功能发生了显著变化：来自Pre-GCs的颗粒细胞是未分化的，并且仅能将少量胆固醇转化为孕酮；卵泡选择后，来自Post-GC的颗粒细胞对FSH产生应答并变成单层紧密间隔的立管（riser）以分泌大量孕酮。

本研究采用Nanopore测序技术对鸡Pre-GCs和Post-GCs颗粒细胞的差异表达基因和转录本进行鉴定，进一步分析了与卵泡选择相关的激素和细胞因子，深入揭示了鸡卵泡选择的分子机制。

材料：35周龄海兰褐蛋鸡Pre-GCs和Post-GCs的颗粒细胞，每组3个重复。

测序平台：Nanopore  PromethION

1、 测序质量和转录本结构分析

6个鸡样品的ONT转录组数据，分别鉴定到2,161,751 - 4,311,415个全长序列，共获得28,581个转录本。在7种选择性剪接(AS)类型中，A3占比最高，为25.28%，MX占比最低，为0.96%（图1A）,它们也是显著AS中最多和最少的事件，比例分别为23.74%和1.12%（图1B）。此外，本研究鉴定了1,381个TF，其中大部分为zf-C2H2家族（图1C）。

图1转录本的 AS、转录因子分析

2、 Pre-GCs和Post-GCs之间lncRNA的表达差异

通过Nanopore全长转录组测序，获得了7,243个lncRNA（图2D），其中459个（10.6%）为lincRNA，906个（21%）为反义lncRNA，2,288个（53%）为内含子lncRNA，664个（15.4%）为正义lncRNA（图2E）。和Pre-GCs相比，Post-GC中共鉴定出925个DE lncRNA（315个上调和610个下调），lncRNA表达变化倍数最大的是LOC107053110.t4（上调）和WSB1.t10（下调）。

图2 转录本的lncRNA分析

3、 Pre-GCs和Post-GCs之间mRNA的表达差异

和Pre-GCs相比，Post-GCs中共鉴定了3,852个差异表达转录本（DETs）（1,755个上调和2,097个下调）（图3A）。这些DET主要富集于糖尿病并发症中肌动蛋白细胞骨架调控途径和AGE-RAGE信号通路（图3B），大多与钙离子结合和肌动蛋白丝结合功能有关（图3C）。其中一些DET在Post-GC中表现出不同的表达模式。例如，ANXA6.t1在Post-GC中上调，而ANXA6.t4在Post-GC中下调（图4）。

图3 Pre-GCs和Post-GCs间DETs的分析

图4同一基因的不同转录本在Post-GCs中表现出不同的表达模式

4、 Pre-GCs和Post-GCs间基因的表达差异

和Pre-GCs相比，Post-GCs中鉴定出2436个差异表达基因（DEG)(964个上调，1472个下调)(图5A)。这些DEGs主要富集在细胞因子受体相互作用通路和ECM受体相互作用通路(图5B)， 大多与细胞外空间和细胞外区域功能相关(图5C)。同时鉴定到卵泡发育相关的DEGs，以及富含激素活性、细胞分化、胆固醇生物合成过程、类固醇激素受体活性和对环磷酸腺苷(cAMP)反应的DEGs（图6）。

图5 Pre-GCs和Post-GCs间的DEGs分析

图6 与激素活性、细胞分化、胆固醇生物合成过程、类固醇激素受体活性及cAMP反应相关的DEGs热图分析

5、 3个DHCR7转录本在Post-GCs中表达升高

Nanopore测序结果显示，DHCR7在Pre-GCs和Post-GCs中存在表达差异，3个DHCR7转录本在Post-GCs中的表达水平均显著升高。DHCR7富集于类固醇生物合成途径(图4B)。这三个DHCR7转录本的序列具有相同的编码区，但具有不同的5个UTRs。5'RACE技术检测到T1和T3转录本。qRT-PCR检测的DHCR7 T1、T3、T4转录本在GCs前后的表达动态(图7)，与转录组测序结果一致。

图7 三种DHCR7转录本在GCs前后的表达

6、 Post-GCs中总胆固醇含量增加

由于DHCR7编码的蛋白可以催化7-脱氢胆固醇形成胆固醇，作者测量了鸡GCs中的总胆固醇含量，发现Post-GC中的总胆固醇含量显著更高（图8）。Post-GC中胆固醇水平的升高可能是由三种DHCR7转录物的表达增加引起的。

图8 Pre-GCs和Post-GCs中总胆固醇的表达

7、 雌激素、孕激素和促卵泡激素（FSH）对Pre-GCs中DHCR7表达的影响

与哺乳动物在颗粒细胞中合成雌激素不同，性成熟的母鸡在分级前卵泡的膜细胞中合成雌激素。为了确定雌激素是否参与调控DHCR7的表达，分别用不同剂量的雌二醇、黄体酮和FSH处理Pre-GCs，发现雌二醇以剂量依赖的方式显著促进DHCR7转录本T1、T3和T4的表达(图9A)。黄体酮对DHCR7转录本的表达均无显著影响(图9B)。低浓度FSH促进三种DHCR7转录本的表达，而高浓度FSH则抑制它们的表达(图9C）。这些数据表明，雌激素、孕激素和FSH对DHCR7表达的影响是不同的。

图9雌激素对Pre-GCs中DHCR7转录本表达的影响

本研究利用Nanopore测序技术揭示了鸡卵泡选择过程中Pre-GCs和Post-GCs之间mRNA和lncRNA的表达差异，并分析了Pre-GCs中DHCR7的表达调控，结果表明雌激素显著促进DHCR7三种转录本的表达。本研究结果可为更好地了解卵泡选择相关基因提供参考，为探索影响鸡卵泡选择效率的因素提供理论依据。