英文标题：MiR-662 is associated with metastatic relapse in early-stage breast cancer and promotes metastasis by stimulating cancer cell stemness

发表时间：2023.7.13

发表期刊：British Journal of Cancer

乳腺癌（BC）是一种常见的女性恶性肿瘤，其转移通常发生在骨骼系统中（即BC骨转移现象），这极大地加剧了患者的死亡风险。尽管已有研究表明miRNA在BC的转移中起重要作用，但具体调控BC转移的机制尚不明确。该研究通过对BC患者血清进行MiRome分析，明确了has-miR-662（miR-662）与BC骨转移的复发有关。进一步的体外细胞检测、RNA测序和动物模型实验等方法，揭示了miR-662通过增强BC细胞中的恶性肿瘤特征（包括增殖、迁移和干性），从而促进BC细胞转移。

研究方法：

采用TapMan^TM低密度阵列（TLDA）对BC患者血清进行MiRome分析。使用动物模型研究miR-662在BC(骨)转移中的作用，并使用过表达miR-662的BC细胞研究miR-662对破骨细胞成熟的影响。使用ALDEFLUOR测定BC的干性。对过表达miR-662的BC细胞进行转录组测序，分析基因的表达水平的变化。

实验设计：

1.早期BC患者血清中高水平的miR-662增加未来发生骨复发的风险

该研究通过TLDA技术检测了48例早期雌激素受体阳性（ER +） BC患者血清中miRNA表达水平，并结合超过10年的临床随访数据，重点分析了后续转移的发生情况。作者比较了未复发的患者（NOMET）和患者的miRNA表达水平（图1a），鉴定出与骨（BONEMET）或软组织（SOFTMET）中转移复发（MET）相关的miRNA（图1b）。差异表达分析显示，与MET、BONEMET和SOFTMET相关的DE-miRNA分别有36、45和40个（图1c）。

对DE-miRNA进行ROC分析，结果显示miR-662在骨复发患者血清中表达水平最高，并且在预测转移复发方面，显示出良好的灵敏度（图1d、e）。此外，Kaplan-Meier生存分析显示，miR-662表达水平高的患者骨转移风险增加了三倍以上（图1f）。

综上，miR-662与骨转移复发风险增加有关，早期BC患者血清中miR-662的表达水平可以预测肿瘤的转移风险。

图1 TLDA技术筛选早期ER + BC患者血清中的miRNA

2. miR-662的表达与BC亚型无关，其过表达增加人BC细胞的转移能力

为明确miR-662在BC和转移中的作用，该研究通过RT-qPCR评估miR-662在人BC细胞系中的表达水平，结果显示，不同BC细胞系中miR-662的表达水平差异很大，表明miR-662的表达与BC亚型无关（图2a-b）。

由于miRNAs模拟物常被用于研究miRNA的生物学功能，且MDA-MB-231细胞系不依赖雌激素的特性，故本研究首先使用miR-662模拟物（MIMIC-miR-662）和对照miRNA模拟物（MIMIC-negCTRL）转染MDA-MB-231细胞系以探索miR-662在BC细胞中的功能。随后进行增殖测定和细胞迁移实验，结果显示miR-662瞬时过表达显著增强了MDA-MB-231细胞的增殖活性（图2d）和迁移能力（图2e）。这表明，miR-662的高水平表达可能会促进BC细胞在体内的转移。

图2 MiR-662在BC亚型中的表达和miR-662过表达对BC细胞增殖和迁移特性的影响

3. 随时间的推移，miR-662在BC细胞中过表达会加剧肿瘤细胞骨转移的发生

为了模拟BC细胞在骨骼中的扩散和转移过程，将miR-662过表达的BC细胞注射到BALB/c 裸鼠心脏中。在接种肿瘤细胞的7周内，每周用生物发光成像（BLI）对小鼠进行监测，以评估骨骼中肿瘤负荷的变化（图 3a）。结果发现，与对照组肿瘤细胞相比，过表达miR-662的肿瘤细胞更容易在骨骼和肺部扩散（图 3b）。此外，与对照组相比，携带miR-662过表达肿瘤的小鼠还表现出更为明显的骨破坏现象（图 3c）。

为评估miR-662过表达肿瘤细胞在功能完整的免疫系统背景下的转移能力，使用MIMIC-miR-662和negCTRL-FAM +（阴性对照）分别瞬时转染小鼠4T1-luc2 BC细胞系，转染72小时后将转染细胞注射到BALB/c小鼠心脏（图3g）。BLI检测结果显示（图3g），与对照组相比，携带miR-662过表达肿瘤细胞的小鼠出现更频繁和明显的骨转移现象。以上表明BC细胞中过表达的miR-662确实会随着时间推移促进肿瘤细胞向骨骼的转移。

图3 BC细胞中MiR-662过表达促进了骨转移的发生

4. miR-662对破骨细胞分化有抑制作用，因此在体内骨转移发生的早期阶段能减轻骨骼肿瘤负担

虽然转移通常被认为是癌症晚期的现象，但已有研究表明BC细胞的全身扩散实际上是一个早期事件。相关研究认为，转移之前会有一个潜伏期，在此期间癌细胞需要在骨微环境中生存并适应。本研究通过过表达miR-662的NW1细胞小鼠模型（图3）发现，在骨转移的早期阶段，骨肿瘤负荷反而减轻，这表明miR-662在骨转移过程中具有双相作用。因此，为了进一步探究miR-662对BC骨内潜伏期的影响，将MIMIC-miR-662或MIMIC-negCTRL-FAM+瞬时转染NW1细胞，并将转染后的细胞注射到雌性BALB / c裸鼠中, BLI结果显示（图 4a），对照组小鼠存在骨骼肿瘤负荷。此外，与对照细胞相比，注射NW1 / MIMIC-miR-662细胞的小鼠的总体肿瘤负荷下降了十倍以上（图4b、c）。

由于BC细胞通过刺激破骨细胞吸收和抑制成骨细胞形成来促进溶骨病变，故进一步探究miR-662在体内骨转移形成早期对骨吸收、骨形成是否有影响。与对照组相比，接种NW1/MIMIC-miR-662细胞的小鼠，TRAcP5b（破骨细胞活性的标志物）水平显著下降（图4d），而P1NP（骨形成标志物）水平保持不变，破骨细胞的数量显著下降（图 4e）。这表明，miR-662可抑制破骨细胞介导的骨吸收，从而在骨转移发生的早期阶段阻止肿瘤的生长。

图4  MiR-662过表达抑制早期阶段骨转移的发生，并影响了破骨细胞的成熟

5. miR-662通过诱导BC细胞表现出类似干细胞的表型从而促进转移

近期研究表明BC细胞具有类似干细胞的表型，是其具有高度致癌潜能的重要特征，这种特性使得这些细胞能够在新的微环境中更好地定植。为探究miR-662的表达是否与BC原发性肿瘤中存在的类干细胞亚群有特异性关联，该研究进行了异种移植（PDX）实验。将ER+或TN原发性乳腺肿瘤植入NOD / SCID免疫缺陷小鼠（图 5a）。在肿瘤切除后，将BC异种移植物分解成单细胞悬液，并根据其醛脱氢酶（ALDH）的活性对细胞进行FACS（流式细胞术）分类，高活性的ALDH作为类似干细胞表型的特征，结果显示miR-662是在高活性的ALDH^high BC细胞中高表达的miRNA之一（图5a）。进一步体外验证的结果显示，与阴性对照相比，miR-662过表达诱导MDA-MB-231细胞的ALDH^high细胞亚群显著增加(图5c)，支持了上述结果。

图5 MiR-662与ALDH^highBC细胞亚群相关，并且MiR-662过表达促进了干性相关基因的表达

进一步对转染36小时后的MIMIC-miR-662和MIMIC-negCTRL-FAM+的NW1细胞进行转录组测序。与模拟转染的细胞相比，过表达miR-662的肿瘤细胞中有38个转录本的表达水平具有显著变化（21个上调，17个下调）(图6a)。基因集富集分析（GSEA）显示，70个基因富集到癌症、免疫系统、翻译等通路相关的基因网络（图6b）。此外，许多被抑制的基因通路与蛋白质合成受损有关，比如翻译、核糖体生物发生和mRNA剪接抑制等（图 6c-e）。这些结果表明蛋白质合成的抑制与癌细胞的干细胞特性有关。

综上表明，miR-662在BC细胞中的过表达促进了癌细胞的干细胞特性，这一发现为理解miR-662在动物模型中促进（骨）转移的作用提供了新见解。

图6 MiR-662的过表达降低了蛋白的合成，增强了BC细胞的类干细胞特性

研究结果表明，早期BC患者的血清中高表达水平的miR-662与癌症的转移潜能和骨破坏过程有关。因此，在BC患者发病初期，测定血清中的miR-662表达水平可能是监测疾病进展和预测未来发生（骨）复发风险的有效方法。这一研究成果有助于推动精准医疗的发展，设计出更为有效的个体化治疗方案以对抗乳腺癌，特别是对于那些难治性的骨转移性乳腺癌。