英文标题：In vitro production of cat-restricted Toxoplasma pre-sexual stages

发表期刊：Nature

发表时间：2023.12.13

主要作者：Ana Vera Antunes, Martina Shahinas, Christopher Swale

作者单位：University Grenoble Alpes

1. AP2介导裂殖子基因沉默

裂殖子作为启动有性生殖的关键阶段，具有独特的转录特征。在本研究中，我们筛选出一种新的裂殖子标志物——致密颗粒蛋白，并探究与MORC和HDAC3相互作用的AP2家族成员中，哪些负责抑制速殖子中裂殖子特异性基因的表达。分别对不同的AP2蛋白进行敲除，只有AP2XI-2或 AP2XII-1失活会导致裂殖子标记物的表达水平显著增加，同时敲除了这两个基因时，裂殖子标记物的表达水平是单独敲除时的三倍以上。在添加3-吲哚乙酸（IAA）48小时后，裂殖子标记物在98%的AP2XII-1和AP2XI-2双敲除的液泡中观察到裂殖子标志物出现延迟但明显的共表达现象，这表明存在与特定裂殖子形态形成相关的时间调控机制。

为了更全面地了解体外裂殖子分化的情况，本研究对所有敲除株系进行了RNA测序分析。层次聚类分析显示，AP2XI-2和AP2XII-1双敲除的弓形虫基因表达谱与体内肠上皮细胞（EES）环境中培养的弓形虫相似。在不同发育阶段，敲除AP2XI-2和AP2XII-1会诱导裂殖子特异性基因表达，同时还抑制了速殖子特异性基因的表达，与AP2XI-2和AP2XII-1的单一敲除相比，同时敲除两者导致上调的基因数量更多。

图1 AP2XI-2和 AP2XII-1的同时敲除会诱导裂殖子特异性基因表达。

2. AP2敲除导致弓形虫生长阶段转换

在对IAA处理的AP2XI-2和AP2XII-1双敲除的弓形虫进行转录和蛋白表达检测时，观察到速殖子程序关闭和裂殖子程序激活现象，在速殖子的侵入功能中发挥重要作用的基因受到抑制，裂殖子和缓殖子特有的基因被显著诱导。在从速殖子到裂殖子的转变过程中，速殖子的表面蛋白也发生了显著的结构调整，IAA处理可诱导90%的SAG相关表面蛋白（SRS）的表达，有效地模拟了体内裂殖子的表型特征。

图2 AP2XI-2和AP2XII-1的双敲除导致弓形虫的生长阶段转换。

3. 体外培养的裂殖子模拟在猫体内培养的前配子

目前已有研究从细胞水平描述了弓形虫性前阶段的特征，并在猫肠道上皮细胞中确定了其配子形成之前所经历的五个形态发育阶段（标记为A-E）。双敲除弓形虫在添加IAA 24小时后，母细胞的细胞核在保持核膜的情况下发生多次分裂，从而形成多核母细胞，在形态上与B、C形态相似，接下来细胞器被分隔到每个子细胞，子细胞以出芽的方式形成排列整齐的内多胞，与D型配子形态相似。进一步延长IAA处理时间至40小时，可以观察到大型裂殖体的存在，其中包含大量正在形成的子细胞，这种形态变化与猫肠道环境中所对应的E型配子形态极为相似。

图3 AP2XI-2和AP2XII-1双敲除的裂殖子发生有核分裂的内多胞体。

4. AP2 蛋白与MORC和HDAC3结合

基于免疫共沉淀的蛋白质组学和Western blot分析,证实了AP2XI-2和AP2XII-1与MORC和HDAC3之间存在显著的相互作用，这一发现暗示它们可能共同参与同一功能复合体。AP2XI-2和AP2XII-1还可以通过一种不依赖于MORC和HDAC3的方式形成异二聚体与DNA协同结合并抑制裂殖子基因表达，并且只有它们同时不表达才能激活裂殖子形成的关键发育程序。

图4 AP2XII-1和AP2XI-2与HDAC3和MORC形成抑制性核心复合体。

5. AP2XI-2 和 AP2XII-1的染色质招募

为了进一步探索AP2XI-2和AP2XII-1对基因的抑制作用，使用染色质免疫沉淀测序技术（ChIP-seq）分析了AP2XI-2和AP2XII-1单敲除和双敲除时的全基因组分布和MORC和HDAC3在染色质上的招募状态。结果显示，在AP2XII-I和AP2XI-2单敲除和双敲除的Chip-seq实验中，仅在前配子中表达的基因在其转录起始位点（TSS）上具有离散且高度富集的峰，同时HDAC3和MORC也在这些AP2转录因子的TSS峰处表现出富集现象。当添加IAA时，观察到AP2XI-2和AP2XII-1从染色质中显著释放，并伴随HDAC3和MORC在TSS区域占有率下降。

为了进一步验证AP2XI-2和AP2XII-1会改变染色质的紧密性和可及性的假设，我们使用染色质转座酶可及性测序（ATAC-seq）进行了分析。结果显示，在基因水平上，IAA诱导的AP2XI-2和AP2XII-1从DNA中动态释放，导致MORC和HDAC3在目标基因TSS处的富集程度大幅降低，从而增强了局部染色质的开放性，进而引起相关目标基因mRNA丰度的增加，其中典型的裂殖子基因受到一致的表达调控。值得注意的是，AP2XI-2在AP2XII-1敲除后并没有从染色质中解离出来，这表明它能形成独立的同源二聚体并有抑制裂殖子的特异性基因的能力。

还有一些基因（次级AP2转录因子）不受AP2XI-2和AP2XII-1的直接调控，因为它们在加入IAA后RNA的表达水平增加，并且具有易于接近染色质的特征，这表明AP2XI-2和AP2XII-1通过间接机制对基因表达起作用，该机制不依赖于其DNA结合活性。

图5 AP2XII-1和AP2XI-2染色质招募HDAC3和MORC。

本研究通过整合RNA测序、蛋白质组学分析、ChIP-seq、ATAC-seq数据以及实验验证，有力地支持了如下理论：AP2XII-1和AP2XI-2蛋白能够形成同源或异源二聚体，并通过与裂殖子基因启动子区域结合，进而招募MORC和HDAC3蛋白，最终实现对速殖子中裂殖子特异性基因的沉默。具体而言，MORC能够进一步组装成二聚体结构，在拓扑结构上捕获DNA环状结构，从而导致染色质致密化，限制转录因子对DNA序列的可接近性，最终抑制相关基因表达。

同时，AP2XII-1和AP2XI-2还调控着在速殖子阶段具有前配子特异性的次级AP2转录因子的表达水平。这些次级转录因子作为下游激活剂或抑制剂，可能在生殖发育过程中发挥显著作用，它们的影响为未来开展功能性配子体外培养以及体外受精技术的研究提供了潜在的可能性。

参考文献

Ana Vera Antunes, et al. In vitro production of cat-restricted Toxoplasma pre-sexual stages. Nature. 2023.