英文标题：Simultaneous nanopore profiling of mRNA m6 A and pseudouridine reveals translation coordination

发表时间：2024.1

发表期刊：Nature Biotechnology

IF：46.9

通讯作者：Tao Pan（University of Chicago）

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）和假尿苷（pseudouridine，Ψ）是哺乳动物中最为丰富的mRNA修饰，然而其功能协同调控机制尚未明晰。本研究开发了一种基于机器学习的Nanopore Direct RNA测序方法——NanoSPA，可同时检测和分析人类转录组中的m6A和假尿苷修饰。进一步将其应用于多聚核糖体测序分析，揭示了m6A和假尿苷在转录组层面呈现出互斥共存现象，以及它们在mRNA翻译过程中表现出的协同和分级效应。

本研究开发的测序分析流程NanoSPA如图1所示，可同时用于两种修饰的碱基识别、序列比对及feature提取，以减少步骤和存储。从Hela细胞m6A-SAC-seq数据及Nanopore Direct RNA测序数据中选择可信度高的m6A完全修饰位点用于模型训练，由此建立并优化了八个motif的前馈神经网络模型（FNN）作为最终模型，在测试数据集中AUC值为0.9776~0.9931之间，说明模型预测效果较好，可以准确预测绝大多数m6A位点（图1b~c）。

图1：NanoSPA方法的表现及验证

为了验证NanoSPA的性能表现，将NanoSPA在公开的人类转录组数据中检测到的m6A位点与三种近期发表的单碱基分辨率m6A检测方法——m6A-SAC-seq、GLORI和eTAM-seq所检测到的m6A位点进行比较，结果表明NanoSPA识别出的7841个m6A位点中，大多数（52.71%）均被上述三种方法识别出来，仅有少数（3.97%）未被任何一种m6A测序方法识别（图1d）。m6A位点检测方法的差异使得准确表征m6A修饰极为困难。然而，NanoSPA识别出的m6A位点与三种正交方法之间存在高度重叠（>96%），同时前述三种方法识别出的m6A位点也更为容易被NanoSPA所识别（图1e）。此外，通过NanoSPA预测出的m6A位点分布与已知的m6A富集分布较为一致（图1f）。由此表明NanoSPA在m6A位点识别方面准确且有效。

使用siRNA对m6A和假尿苷两种关键甲基化转移酶METTL3和TRUB1进行敲除实验和Nanopore Direct RNA测序，并应用NanoSPA进行修饰位点识别，结果显示对照样本中含有较多假尿苷位点的转录本则包含较少的m6A位点，而含有更多m6A位点的转录本则存在较少的假尿苷修饰，说明m6A和假尿苷修饰在同一个转录本中共存的可能性较低（图1g~h）。分析敲除样品的m6A和假尿苷的变化情况，发现METTL3或TRUB1的敲除会导致其对应修饰程度降低，同时在含有较多m6A位点的转录本中，METTL3敲除可使得假尿苷修饰显著增加，而在含有较少m6A位点的转录本中则没有明显变化，说明m6A修饰可抑制假尿苷修饰发生（图1i）。然而TRUB1敲除样本中m6A修饰反而有所下降（图1j），与对照样本中m6A和假尿苷互斥共存的现象相反，推测原因为TRUB1酶可能促进m6A修饰发生，而其他假尿苷修饰酶则会抑制m6A修饰，表明m6A和假尿苷修饰之间存在动态调控。

为了研究m6A和假尿苷对翻译过程的影响，将NanoSPA应用于多聚核糖体分析（图2a），METTL3和TRUB1的敲除均导致80S单体以上的多聚核糖体数量减少，尤其是TRUB1敲除后更为显著，推测TRUB1酶缺失会显著影响翻译过程。GO富集分析表明，多聚核糖体结合比例下降最明显的转录本与蛋白质合成过程较为相关（图2b），而多聚核糖体结合比例增加最多的转录本则与细胞器有关。

图2：NanoSPA方法应用于多聚核糖体分析

多聚核糖体的mRNA上的m6A修饰和假尿苷修饰水平与对照mRNA大致相似（图2c~d），而不同转录本的多聚核糖体结合比例却有所差别。每条转录本的多聚核糖体与mRNA结合的比例被称为翻译效率，已有研究表明翻译效率较高的转录本可认为在翻译过程中受到正向调控，结果显示m6A修饰程度更高的转录本的平均翻译效率会更高（图2e）。不同翻译效率下，多聚核糖体的m6A修饰程度也较高，表明多聚核糖体上的m6A修饰有利于翻译过程的进行（图2f），假尿苷修饰亦是如此（图2g）。

进一步研究m6A和假尿苷关键转移酶缺失对多聚核糖体的影响，发现METTL3敲低后mRNA的m6A修饰程度降低，而多聚核糖体中则与对照相近，同时METTL3敲低后翻译效率变化并不明显，并且含m6A较多的转录本仍然比含m6A较少的转录本具有更高的翻译效率（图2h）。TRUB1敲低后，多聚核糖体的假尿苷修饰水平则均有所降低，同时翻译效率均显著下降，而且不受m6A修饰状态的影响（图2i~k）。以上结果表明，转录本中m6A和假尿苷在多聚核糖体累积上具有协同效应，但存在一个层级关系，即假尿苷对翻译效率的影响大于m6A。

已有研究对于m6A和假尿苷修饰分析往往分开进行，本研究开发的基于机器学习的Nanopore Direct RNA测序方法——NanoSPA，可同时检测和分析人类转录组中的m6A和假尿苷修饰，填补了两者在同一mRNA分子内相互作用的机理研究的空白，揭示了m6A和假尿苷修饰在转录翻译过程中的协同作用。

参考文献：

Huang S, Wylder A C, Pan T. Simultaneous nanopore profiling of mRNA m6A and pseudouridine reveals translation coordination[J]. Nature Biotechnology, 2024: 1-5.