传统的RNA测序技术（如RNA-Seq）通常需要将RNA先反转录为cDNA，经过扩增后再进行测序。这个过程不仅过程繁琐，还可能引入偏差，从而可能影响结果的准确性。而直接RNA测序技术（Direct RNA Sequencing，简称DRS)能够直接对RNA分子测序，无需转录为cDNA，直接获得mRNA的序列及其修饰信息。龙8总区基因的DRS分析内容，主要分为以下三大核心模块：

1. RNA修饰分析（包括m5C、m6A、假尿苷等）

DRS修饰检测的软件开发已成为科研关注的焦点。自官方推出的Nanopolish与Tombo以来，学术界陆续在权威期刊上发表了MINES, Nanom6A, m6Anet等软件，也广泛应用于RNA修饰的检测，极大地拓宽了RNA修饰检测的范围，提升了检测准确性。目前，可以精细识别全motif的m5C、m6A、假尿苷等修饰。下面以m6A修饰检测为例，详细介绍DRS测序在RNA修饰方面的分析内容。

与常用的MeRIP-seq技术相比，DRS无需阴性对照，能直接获得参考转录本集合的单碱基位点级别（site-level）的修饰信息。预测过程中，首先将转录本集合作为参考，将reads比对到参考，然后根据特定的motif提取对应的信号特征以推断位点级别修饰程度。与MeRIP采用foldchange评估峰的m6A程度不同，DRS能区分每一个待选位点是否为甲基化，并统计甲基化reads占总reads的比例，用于量化修饰程度。这一指标在不同软件中有Fraction、Ratio、Probability等多种称谓。

完成修饰程度鉴定后，进一步探究甲基化在基因组上的整体分布、在基因结构上的分布以及motif情况，如下图所示。

图1：在基因组上高水平甲基化位点的分布：颜色深浅代表该区域甲基化程度的高低

图2：在基因结构上高水平甲基化位点的分布：虚线划分出5’UTR、CDS及3’UTR区域

图3：高水平甲基化位点周围的motif

2. Poly(A)尾的分析（包括长度与位点）

DRS技术可以同时检测Poly(A)尾长度与Poly(A)位点，并可以将两者相关联，深入探究两者之间的相互作用关系。

鉴于DRS是根据电信号解析碱基，无法直接从原始数据中确定Poly(A)尾的确切长度，因此需要借助reads过孔时的速度进行间接推算。常用的估算Poly(A)尾长度的软件有Nanopolish、Tailfindr、Dorado等，无论是在有参还是无参的情况下都能准确估算Poly(A)尾长度。进而通过统计学方法比较不同样品间Poly(A)尾长度的差异。

图4：不同样品Poly(A)尾长度的箱线图

DRS技术会富集含有poly(A)的序列，因此测到的reads 90%以上均能测到完整的3’ 端信息。使用minimap2将reads比对到参考基因组上，比对的终止位置即为poly(A)位点。在对每个样品的poly(A)位点进行鉴定后，进一步比较不同组间的近远端位点转换、3’UTR长度变化以及PAS信号强度的差异。

图5：近远端PAS信号差异图

3. 常规的序列分析

在常规序列分析中，DRS技术凭借其独特优势，在转录本鉴定、融合基因识别、可变剪切分析、转录本定量等方面展现了显著优势。针对DRS开发的软件也层出不穷，例如用于三代定量的Bambu (Nat Methods,2023)和NanoCount (Nucleic Acids Research,2022)，用于融合基因鉴定Fusionseeker (Cancer Res,2023)，以及用于转录本识别的Isoquant (Nat Biology,2023)和LAFITE(Advanced Science,2022)。随着新一代试剂盒RNA004的诞生，DRS在产量、质量以及修饰检测的准确度方面都进一步提升。随着技术的持续进步，我们相信未来将涌现更多先进的分析手段以助力遗传信息的深度破译与精准解读。

总之，DRS正迅速成长为多组学研究领域的一颗璀璨明星，其快速发展不仅有力推动了基础科学研究的进步，也将为临床医学、药物开发等领域带来深刻变革。我们期待在未来，DRS技术能进一步揭开生命的奥秘，为我们提供更深入的生物学见解和更精准的科研解决方案。

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