英文标题：The rise of epitranscriptomics: recent developments and future directions

发表时间：2023.12

发表期刊：Trends in Pharmacological Sciences（IF：13.8）

通讯作者：史艳红教授，美国克曼研究所

RNA中的N6-甲基腺苷(m6A)可逆性和广泛分布性揭示了表观转录组学广阔的研究前景。目前，绘制全转录组RNA修饰图谱以及在疾病背景下探索RNA表观转录组的调控机制，对于阐明基础生物学机制和推动药物研发至关重要。近期该领域的研究热点涵盖了RNA修饰检测方法的革新，以及如何借助这些技术来增进对RNA表观转录组复杂性的认识，特别是在癌症和其他疾病的药物研发领域。未来，精准靶向RNA修饰并调控其对RNA加工过程影响的表观转录组工程将是一个极具潜力的研究领域。

1. 表观转录组学的兴起

自20世纪50年代以来，人们逐渐认识到RNA分子中存在多种修饰核苷酸，其中早期研究主要集中在对rRNA和tRNA结构至关重要的修饰。直到2011年发现m6A这种可逆的RNA内部修饰及其由FTO蛋白介导的去除过程后，表观转录组学才迎来了重大突破。

m6A作为一种被深入研究的关键RNA修饰，通过动态且可逆的添加过程影响RNA代谢各个环节，且在发育、组织稳态及疾病发生过程中扮演重要角色，尤其在癌症中与肿瘤进程中的基因表达调控密切相关，为针对m6A修饰机制开发癌症治疗策略（如白血病和胶质母细胞瘤）提供了新思路。

2. 转录组范围内RNA修饰检测技术的进步

（1) RNA修饰的位置和分布

m6A可逆性及修饰机制的发现对理解其在RNA加工调控中的作用至关重要。2012年，通过MeRIP-seq和m6A-seq抗体富集方法首次实现了全转录组m6A景观的绘制（图1A），但受限于约100-200nt片段分辨率。

为实现单核苷酸分辨率并精确定位单个m6A位点，后续研究采用了交联抗体提升反转录时m6A位点附近突变特征的方法；同时开发非抗体依赖方法，如DART-seq利用融合YTH结构域的APOBEC1胞嘧啶脱氨酶在m6A附近诱导C-to-U转换（图1B）。此外，化学与代谢标记策略也被用于直接在m6A位点引入突变或富集修饰RNA（图1C）。RNase MazF因其对m6A敏感而无法切割特定序列（ACA），这一特性也被用于m6A定位（图1D）。

（2) RNA修饰的细胞异质性

scRNA-seq（单细胞RNA测序）技术揭示了细胞内基因表达的空间与时间差异。结合m6A检测技术如scm6A-seq和scDART-seq，可在单细胞分辨率下描绘m6A的异质性。单细胞m6A分析揭示稀有细胞亚群特异性修饰位点及细胞间摩尔比例差异，并通过m6A模式将细胞分类。

（3) RNA修饰的摩尔比

RNA转录本在细胞中可有数十至数百份拷贝，其修饰摩尔比是指某一时刻被修饰的比例，该调控机制及其功能意义尚待阐明。量化方法包括使用校准探针标准化检测流程，如m6A-SAC-seq通过校准探针记录了HSPC分化中m6A摩尔比的动态变化，并将其与选择性剪接相关联。eTAM-seq（图1E）和GLORI利用脱氨基化反应精确量化m6A摩尔比（平均约40%），揭示其动态变化与翻译效率的显著关联。

（4) 从第三代测序技术中获得的见解

第三代测序技术和机器学习在表观转录组研究中发挥了重要作用。纳米孔测序能直接读取原始RNA分子，保留其修饰状态，被广泛用于检测m6A等RNA修饰（图1F）。通过生物物理信号分析和算法，能够从原始数据中识别RNA分子上的修饰。比较方法如DRUMMER和ELIGOS无需训练数据但依赖修饰耗尽对照样本，而监督学习工具如m6Anet和DENA利用已标注的数据集预测未知修饰，无需对照。机器学习还可根据序列信息从零预测修饰。纳米孔测序能实现单碱基分辨率及摩尔比定量，并有潜力同时检测多种RNA修饰，如CHEUI算法应用于推断m6A和m5C的共现模式。

图1 m6A的检测方法

3. 专注于表观转录组学的药物研发

（1) 靶向RNA修饰机制

肿瘤图谱在揭示癌症中失调并具致癌作用的RNA修饰相关蛋白（如效应器）方面扮演了关键角色（图2A）。因此，研发小分子抑制剂以阻断致癌RNA修饰酶活性成为可能。虚拟药物筛选是高效且经济的方法，已被用来识别对抗包括FTO、IGF2BP2及PUS7等RNA修饰相关蛋白的小分子候选物（图2B）。同时，无细胞实验的传统药物筛选也被用来发现METTL3和YTHDF2的潜在抑制剂（图2C），并通过体外实验验证这些化合物的抑制效果（图2D）。

（2) 除了癌症以外的疾病治疗开发

药物研发集中于癌症中失调的RNA修饰机器和依赖性，但表观转录组学研究进展也为治疗其他疾病如糖尿病、心脏病、神经退行性疾病等提供了可能。这些疾病的表观转录组失衡表明修复异常通路有助于恢复稳态。COVID-19 mRNA疫苗的成功研发就运用了RNA修饰功能知识，如在疫苗中加入N1-甲基假尿苷（Ψ）以减少免疫原性和确保有效性。

图2 通过药物靶向干预，可以逆转由表观转录组失调导致的与疾病相关的表型特征

4. 在机制研究中对表观转录组进行工程化改造

（1) 用于设计和操作RNA修饰的分子工具及其应用场景

CRISPR/Cas技术的快速发展使其能够通过sgRNA精确引导Cas核酸酶，实现广泛的基因工程改造。针对RNA的dCas13可与各种RNA修饰蛋白融合以进行RNA修饰工程，可在特定位置添加或移除RNA修饰（图3A）。除了CRISPR/Cas系统外，通过sgRNA也能调动细胞内源性的RNA修饰机制。例如，已有两个研究团队证实，sgRNA可以引导内源性假尿苷化机制在目标RNA上安装Ψ（图3B）。

图3 RNA修饰工程的分子工具

RNA修饰工程研究揭示了RNA修饰对RNA加工过程（如剪接、输出、结合蛋白相互作用和稳定性）的影响。通过定点甲基化Brd8 mRNA和Actb mRNA的特定位点，证实单个m6A位点足以显著影响RNA加工与稳定性（图4A）。除了设计RNA修饰，还可以定向招募reader蛋白以研究其下游效应。例如，YTHDF1和YTHDF2分别调控mRNA翻译和降解，利用dCas13标记GFP实现实时追踪mRNA（图4B），有助于阐明reader蛋白在RNA定位、转运及应激颗粒形成等过程中的作用，并可能发现它们在复杂生物过程（如神经元突触形成）中的新功能。此外，RNA修饰工具封装于AAV载体实现体内递送，有助于研究如突触可塑性、学习记忆等复杂表型，以及肿瘤生长转移、免疫微环境等生理病理过程（图4C）。

图4 分子工具在研究不同生物学过程中RNA修饰的应用

（2) RNA修饰工程面临的挑战与局限性

尽管RNA修饰工程有力揭示单个RNA修饰对加工的影响，但需注意相关的技术挑战。尤其是在编辑效率与非特异性活性的控制方面，需要考虑到RNA分子的多拷贝性和动态周转特性。评估工具如m6A-SAC-seq、eTAM-seq及BID-seq可用于检测编辑目标效率和修饰水平，而全转录组分析则有助于评判非特异效应。

自2011年确认m6A为可逆修饰以来，表观转录组学领域取得了迅速发展，检测技术的改进促进了对RNA修饰机制的理解以及药物靶点的研究，尤其在癌症领域。随着研究深入，提升RNA修饰映射与工程化技术至关重要，以揭示调控机制及其下游生物学效应。纳米孔测序等新技术有望提高修饰检测分辨率，而定向进化蛋白质工程则能开发新型标记酶。完善的表观转录组图谱结合机器学习将推动检测方法进步、预测RNA修饰，并助力癌症治疗靶点发现和药物设计。未来，针对表观转录组的治疗策略不仅限于癌症，也可能广泛应用于其它人类疾病。

参考文献：

Cerneckis J, et al. The rise of epitranscriptomics: recent developments and future directions. Trends Pharmacol Sci. 2024 Jan;45(1):24-38.