在细胞中，转录组测序所得绝大多数reads通常是丰度较高的转录本，低丰度转录本如长链非编码RNA（lncRNA）及新转录本的检测往往十分困难。本研究采用牛津纳米孔测序技术中的自适应采样策略，在无需生化处理的情况下实现对目标RNA的选择性去除或富集。实验表明，通过自适应采样技术，体外转录的混合RNA中目标转录本的比例提升了22%至30%。应用该技术对不同比例的白色念珠菌（Candida albicans）进行转录组测序，目标转录本的reads数增加了11%至13.5%，同时发现较长且高表达的转录本更易被有效去除，此外还揭示了26个先前未被识别的转录本和剪接异构体，其中17个是已知转录本的反义转录本。

文章标题：Direct RNA sequencing coupled with adaptive sampling enriches RNAs of interest in the transcriptome

发表杂志：Nature Communications（IF=16.6）

发布时间：2024年1月11日

近年来，直接RNA测序技术的进步，使研究者能够在无需反转录的情况下实现转录本鉴定和定量分析，其原理是原始RNA分子在电压差的作用下可以按照3′端到5′端方向穿过纳米孔，并将电流信号变化解码为相应的碱基信息和修饰信息，从而全面表征RNA的各种异构体、剪接变体、融合转录本及3′端多腺苷酸化等结构特征及其甲基化修饰情况。然而，由于直接RNA测序的通量低于纳米孔DNA测序，因此对低丰度转录本的检测效率不高。

纳米孔测序的“read until”的功能，可根据需要选择性地测定或跳过特定序列。利用自适应采样策略时，在单个纳米孔中，一旦RNA链的部分序列被检测到并比对上预设的关注序列，可以适时调整电压以排斥不相关的RNA片段，促使纳米孔重新准备接受目标RNA链。这一机制简化并增强了对目标转录本的选择性富集或去除过程。

1、自适应采样技术能够富集RNA群体中的目标RNA

为了测试自适应采样在直接RNA测序中的应用效果，研究人员首先合成了三种不同的RNA（18S rRNA、β-肌动蛋白和GAPDH），以及牛津纳米孔技术公司的直接RNA测序试剂盒中提供的ENO2 RNA，形成四种RNA的混合池，随后进行文库制备和直接RNA测序。结果显示，自适应采样能够有效富集RNA群体中的目标转录本。

为了优化对低丰度GAPDH RNA的富集，研究者调整了决策时间参数（1秒、3.5秒和6.5秒）。结果显示，较短的决策时间可能导致鉴定的准确性不足，而过长的决策时间则会增加冗余的测序碱基，降低采样效率。在优化条件下，相较于常规批量测序方法，采用3.5秒决策时间时GAPDH序列reads数增加了22%，而在6.5秒决策时间下增长了7%；同时，匹配到GAPDH上的碱基数分别提高了26.5%和8%。此外，该策略对GAPDH的错误拒绝率保持在较低水平，表明自适应采样具有良好的准确性。

图1 纳米孔自适应采样工作流程示意图

2、自适应采样技术可以减少RNA群体中的目标RNA

作者进一步测试了自适应采样在去除高丰度转录本方面的效果。作者选取了ENO2这一最丰富的转录本作为去除目标，在不同的决策时间（2秒至4.5秒）下进行实验。结果显示，从2秒决策时间起，自适应采样成功地降低了ENO2转录本的reads数，从批量测序时的54,580下降到了12,730，与此同时，非ENO2转录本的reads数增加了34%。表明，在适宜的决策时间内，自适应采样技术能够有效地去除高丰度转录本，进而揭示更多关于低丰度转录本的信息。

图2 自适应采样减少目标转录本

3、自适应采样技术能够对转录组中的特定RNA分子进行选择性去除或富集

作者将自适应采样策略运用在白色念珠菌(Candida albicans)的转录组研究中。常规直接 RNA 测序，鉴定到3877个转录本，但其中最丰富的前150个转录本占总测序reads的55%，这显著阻碍了低丰度转录本的有效检测。

图3 自适应采样技术在转录组中富集特定的RNA分子

作者挑选了319个表达量位于第80~90百分位的转录本作为目标，其中包括41个与形态转变和感染过程密切相关的基因，占到全部转录本的5.4%。采用3.5秒决策时间的自适应采样策略，精准地富集了这319个目标转录本，仅1.9%误入拒绝池，体现出高精度的选择性能。尽管富集模式下，目标转录本的绝对reads数未明显增多，但在去除模式中，目标转录本的reads数提高了13.4%。通过去除前述中的150个高丰度转录本，剩余转录组的测序深度提升了11.15%，由此说明这一策略有助于发现新转录本尤其是低表达转录本。实验结果还显示，在自适应采样过程中，较长的转录本更易于被有效去除或富集。

图4 转录组中的较长转录本更易被富集

自适应采样技术能够根据决策时间的设定，有效调整Candida albicans中特定基因ENO2、GAPDH、18S rRNA和ACTB在测序数据中的reads分布。例如，在3.5秒决策时间时，该技术成功减少了ENO2和GAPDH基因在拒绝池中的reads数，实现对目标转录本的有效去除或富集调控。

总之，本研究表明自适应采样技术可以应用于直接RNA测序，不仅能够针对性地富集捕获目标RNA，也能高效选择去除特定转录本，从而提高整个转录组中低丰度转录本的检测效率和覆盖范围。随着该技术的不断改进，未来有望广泛应用于各类转录组中特定RNA的研究。

参考文献：

Wang, J., Yang, L., Cheng, A. et al. Direct RNA sequencing coupled with adaptive sampling enriches RNAs of interest in the transcriptome. Nat Commun 15, 481 (2024).

文献下载链接：//www.nature.com/articles/s41467-023-44656-3