英文标题：Tolerance of repeated toxic injuries of murine livers is associated with steatosis and inflammation

发表期刊：Cell Death and Disease

发表日期：2023.7.12

作者单位：Medical Faculty Mannheim

慢性肝损伤会触发一系列连锁反应，包括肝脏免疫细胞的浸润与激活、炎症反应、伤口愈合过程以及纤维组织合成增加，这些变化导致正常肝脏逐渐被纤维化组织取代，最终形成肝硬化。值得注意的是，早期的肝纤维化乃至肝硬化是可逆的。此前关于毒性损伤引起的肝纤维化研究主要集中在比较不同阶段的肝纤维化程度，而肝脏对反复损伤所发生的动态多水平反应变化机制及其关键转换点尚不明确。

本研究运用转录组和蛋白组等多组学分析，揭示了在小鼠模型中反复诱导产生的肝纤维化进程可分为三个明显阶段——初始阶段、发展阶段和耐受阶段。其中耐受阶段的开始是肝脏适应损伤的关键转折点，这种耐受机制的核心在于脂质代谢调控和轻度炎症状态。进而推测这些过程可能作为内在的保护机制来抑制纤维化进展，并有可能成为诊断慢性肝病的潜在生物标志物。

1、在经过六周诱导后，肝脏纤维化的反应程序发生了变化

小鼠经过六周的CCl4诱导注射后，未出现进一步数量减少的现象，这表明存活至第六周的小鼠已形成了一种对损伤的耐受机制（图1 b）。在CCl4诱导处理后，胆管损伤标志物碱性磷酸酶（ALP）和肾功能损伤标志物血尿素氮（BUN）与对照组相比并未显示出显著差异；而甘油三酯（TG）则表现出时间依赖性的持续升高；肝损伤标志物血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）活性均有所上升，其中ALT水平在第二周达到峰值，而在第六周之后，AST并未再有进一步的增加（图1 c）。结合这些表型信息和存活率数据，我们可以推测肝脏的反应程序在第五周至第七周之间转变为了一个可耐受的纤维化阶段。

图1 肝纤维化动力学的血液、组织病理学和生化分析

3、基于组织的纵向分析显示，肝脏反应过程可以划分为三个阶段

通过结合组织病理学和生化分析手段，可在结构水平上系统检测肝脏对毒性刺激的动力学反应。在CCl4处理的小鼠模型中，关键代谢酶细胞色素P4502E1（CYP2E1）的蛋白表达量在六周后显著降低并趋于稳定（图1 d）。同时，活化的肝星状细胞（HSCs）中的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在CCl4诱导治疗的前六周表现出大量积累，并且促进了纤维化细胞的生成；然而，在六周之后，其表达并未进一步增加。通过量化微天狼星红（PSR）阳性的区域发现，与细胞外基质（ECM）沉积相关的变化同样如此，在CCl4连续给药六周后并未见明显增多（图1 d）。此外，羟脯氨酸在肝脏中的含量变化进一步证实了ECM相关改变并非偶然现象，而是由连续给予CCl4所导致的全器官水平上的转变（图1 e）。这一系列生化和组织病理学分析结果共同揭示了在毒性物质诱导下，肝脏反应过程经历的不同阶段，并表明在六周之后，肝脏进入了一个能够耐受反复毒性损伤的新阶段，而这一变化并不依赖于CCl4代谢产物的激活作用。

4、转录组学和蛋白质组学数据揭示了肝纤维化调控过程可以被划分为三个阶段：初始阶段、发展阶段以及耐受阶段。

在组织水平观察到的结构动态变化可能反映出潜在的分子机制变化，因此本研究通过转录组学和蛋白质组学对此进行了探究。选取了经过不同时间点（0、2、4、6、8、10周）CCl4处理的小鼠样本进行转录组测序和蛋白组检测（图2 a）。结果显示，在第六周时与对照组相比，差异基因数量最多，共有1812个差异基因被识别出来（图2 b,c）。基于主成分分析（PCA），我们将早期肝纤维化的形成阶段划分为三个时期：I期（第0-3周）、II期（第4-6周）以及III期（第7-10周）。对这三个阶段中的差异基因分别进行富集分析后发现，在I期和II期中ECM通路显著富集，而到了III期，该通路相关基因的数量有所减少并趋于稳定。在这三个时期的差异基因群中，有467个基因共同在ECM和炎症途径中表现出富集现象（图2 c）。

进一步分析显示，在第三阶段（即III期）中，差异基因的数量呈现下降趋势（图2 d），这与之前关于肝脏对重复损伤适应性的发现相一致。因此，我们把这一阶段命名为“耐受阶段”。针对耐受阶段的差异基因进行时间序列表达分析（图2 e），揭示出一些纤维化相关基因如肌动蛋白α2平滑肌亚型（Acta2）、Ⅰ型胶原α1链（Col1a1）和Ⅰ型胶原α2链（Col1a2）在第六周耐受阶段时其表达量均下调（图2 e）。此外，值得注意的是，脂肪酸合成酶（Fasn）这一参与脂肪生成过程的基因在耐受阶段后期表达量有所增加（图2 d,e）。

图2. CCl4处理下，肝脏的时间分辨转录组分析。

蛋白组检测到4222个蛋白质，对在所有样品中均检测到的2278个蛋白质进行后续差异蛋白分析（图3 a）。研究发现，蛋白组调控模式与转录组调控特征类似，特别是在Ⅰ期和Ⅱ期，相关蛋白质在ECM途径上表现出显著富集（图3 c,d）。对纤维化相关蛋白进行时序表达分析后，我们观察到这些相关蛋白、酶以及多肽在耐受阶段（第8-10周）也保持稳定的表达状态（图3 e）。数据显示，在第一阶段出现表达变化的所有基因中有95%的基因及75%的蛋白质在后续阶段并未发生进一步变化，这表明肝脏对压力刺激的反应具有普遍稳定性（参见图2d和图3d）。

根据之前在不同分析层面得到的数据，可将肝脏对早期损伤的动态反应归纳为三个明确阶段：初始阶段（1-2周），表现为对重复性损伤的即时响应机制；发展阶段（4-6周），在此期间反复损伤导致分子水平的变化逐渐积累；而到了耐受阶段（第8-10周），肝脏开始展现出对重复性损伤的承受能力。

图3. CCl4处理下，肝脏的时间分辨蛋白质组学分析

5、肝脏耐受性的多层网络分析揭示了人类肝脏疾病概况

结合转录组学、蛋白组学、生化分析以及组织病理数据，我们运用KiMONo（一种多层网络推理策略）来探究肝脏重复损伤过程中的关键因素（如图3 f和图4 a,b所示）。

在构建的多层纤维化网络中，节点代表了蛋白质、基因或生化参数，而连接则表示这些实体之间统计上显著的作用关系，整个网络包含了16,398条连接和8,199个节点。通过对与耐受阶段失调基因和蛋白质相关的节点进行提取，我们识别出了该阶段特有的网络模块。根据模块内基因富集分析的结果，我们将最显著的模块分类为炎症相关模块、脂质代谢模块、癌症相关途径模块、碳水化合物代谢模块、nf-KB信号传导模块以及免疫系统相关模块（参见图4 a和b）。

进一步地，我们将差异表达基因与人类肝脏疾病样本进行了比较，分别计算了每种人类肝脏疾病中基因的差异表达情况，并将这些基因的表达水平与其对应正常对照样本进行对比。结果显示，上述大部分模块的表达模式与人类肝脏疾病样本中差异表达基因的调控方向一致。

图4. CCl4处理下，肝纤维化耐受阶段的特异性模块。

5、多层模块的组织学和生化验证可识别耐受阶段的脂质代谢和轻度炎症

在耐受阶段，为了验证所检测到的模块，首先聚焦于炎症与肝病进展之间的已知关联，并通过免疫荧光（IF）、免疫组织化学（IHC）以及实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行了验证。在CCl4处理组中观察到纤维化区域内的组织存在空洞结构（图5 a），同时伴有充满脂滴（LD）的肝细胞增加（图5 b），并且随着时间推移，细胞内脂质积累显著上升（图5 c）。

通过RT-PCR进一步验证了脂质代谢模块中的基因节点。重点分析了新生脂肪生成的核心调节因子——脂肪酸合酶（Fasn）、固醇调节元件结合转录因子1（Srebp-1c）和硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Scd1）。结果显示这些基因在CCl4诱导产生的纤维化耐受阶段明显上调（图5 d）。

为了进一步比较CCl4耐受肝脏中脂滴大小的变化，利用STelic动物模型（基于脂肪变性的STAM小鼠模型）进行研究，发现在CCl4耐受肝脏中，尽管脂滴体积较小，但微小脂滴在肝细胞中有累积现象，这与STAM小鼠相比具有显著区别（图5 e）。这种调控机制有助于保护肝脏免受CCl4引起的额外损伤。鉴于脂滴积累是由脂肪生成和降解共同控制的，本研究进一步探讨了起始或进展阶段是否存在自噬介导的脂滴降解机制。采用典型自噬标志物LC3、PLIN3和LAMP1进行IF染色（图5 f）和RNA分析（图5 g），结果显示在整个过程中起始、进展及耐受阶段之间并无显著变化，提示从头合成脂质是导致脂滴在整个进程中积累的主要原因。

通过对临床慢性肝病（CLD）患者队列中210个鉴定出的耐受相关基因进行分析发现，在重复CCl4中毒的情况下，识别出的与假设耐受阶段相关的基因与微小脂滴的积累以及轻度炎症状态有关。

图5.肝脏反应耐受期脂质代谢诱导的验证。

基于对蛋白质组学、转录组学以及血液和组织病理学水平的全面分析，本研究将早期肝纤维化的进程划分为三个明确的发展阶段：初始阶段、发展阶段及耐受阶段，并指出耐受阶段的启动是肝脏在适应并耐受损伤过程中的关键转变节点。该研究揭示了脂质代谢紊乱及其伴随的轻度炎症反应可能作为抑制肝纤维化进展的一种保护性机制，并且提示与脂质代谢相关的关键指标及轻度炎症状态具有成为潜在诊断肝纤维化生物标志物的价值。

参考文献：

Hammad S, et al. Tolerance of repeated toxic injuries of murine livers is associated with steatosis and inflammation. Cell Death and Disease. 2023