Direct RNA测序（DRS）基于Nanopore测序平台，不经反转录、无需扩增，直接读取全长转录本，无测序偏好性。可以检测单个RNA分子上单碱基的m6A、m5C和假尿苷等RNA修饰位点；能准确分析可变剪切、APA、融合基因和鉴定新转录本；此外，还可对Poly(A)长度进行相对准确的估算，还原真实的RNA特征。

Direct RNA测序，作为一项革命性的高通量测序技术，正以其独特的优势在植物胁迫抗逆与动物应激响应研究领域引发广泛关注。这一技术摒弃了传统的RNA测序中繁琐的反转录和PCR扩增步骤，允许研究人员直接从原始RNA分子中获取序列信息，从而实现了对转录组动态变化前所未有的精准捕捉。尤其在面对植物应对复杂环境压力以及动物应对生理或病理应激的场景时，DRS的实时性和全面性等特征使其成为揭示生物快速响应机制的理想工具。

在植物胁迫抗逆研究中，DRS能够直接揭示逆境条件下转录本的全长序列和末端结构，这对于理解植物如何通过调控转录起始、终止以及可变剪接等方式来适应水分短缺、盐碱侵袭等环境胁迫至关重要。在动物应激响应研究方面，DRS同样展现出强大的应用潜力。这对于理解动物在急性或慢性应激刺激下如何迅速调整转录过程，以及不同应激响应基因间的协同作用具有重要意义。目前关于DRS应用于植物胁迫抗逆及动物应激响应方面的研究报道层出不穷。

文章题目：N6-methyladenosine-mediated feedback regulation of abscisic acid perception via phase-separated ECT8 condensates in Arabidopsis

发表期刊：Nature Plants

影响因子：18.0

发表时间：2024.3

植物遭受外界逆境胁迫时，m6A修饰的动态可逆变化能够快速调控基因表达，从而赋予植物极强的环境适应性。研究表明，逆境胁迫能够迅速诱导植物体内ABA的积累。本研究发现，m6A修饰识别蛋白ECT8可以作为细胞内ABA浓度的分子感受器，直接调控ABA信号途径及拟南芥对干旱胁迫的响应。在ABA的诱导作用下，ECT8的表达水平和蛋白水平显著增加，同时弥散分布于细胞质内的ECT8蛋白可在细胞内形成动态的颗粒状结构。进一步研究发现，ECT8蛋白可以与应激颗粒（Stress granule）的核心调控蛋白Rbp47B结合，证实ECT8凝聚体是应激颗粒的组成部分，并且在ABA处理或逆境胁迫状态下将携带m6A修饰的mRNA聚集于应激颗粒中。通过DRS对ABA处理条件下应激颗粒中mRNA组成进行分析，明确了ECT8对应激颗粒中mRNA m6A修饰的动态调控作用。此外，多种逆境胁迫条件，如高温、盐胁迫以及渗透胁迫等，均可诱导ECT8蛋白形成相分离的应激颗粒，表明m6A识别蛋白ECT8凝聚体的形成是植物应对多种逆境胁迫的重要适应策略之一，由此揭示了m6A修饰如何通过反馈机制参与植物激素ABA信号感知的新机制。

文章题目：Long-read direct RNA sequencing reveals epigenetic regulation of chimeric gene-transposon transcripts in Arabidopsis thaliana

发表期刊：Nature Communications

影响因子：16.6

发表时间：2023.6

转座子作为一种DNA遗传元件，广泛分布于真核生物的基因组中。部分转座子序列的共转录和外显子化，会产生嵌合转座子基因（TE-G）转录本，进而产生新基因，在植物生长发育和环境响应中可能发挥重要作用。本研究利用DRS和新开发的专用生信工具ParasiTE检测分析了拟南芥转录组中3000多个TE-G转录本，发现5'/3'-UTR中的转座子可通过可变转录起始位点ATSS和可变转录终止位点ATTS，抑制下游TE-G基因的转录或调控基因的环境响应和RNA稳定性，为转座子和基因之间的相互作用提供了新的见解。

其中，作者收集了多个生物/非生物胁迫处理的转录组公共数据集，深入研究了不同胁迫下典型的ATE-G转录本和具有突变特异性的Epi-ATE-G转录本的差异使用和差异表达，结果表明环境胁迫可能通过表观遗传调控影响转座子isoform的转录和形成，有助于植物对环境变化的适应。

文章题目：Drought induces epitranscriptome and proteome changes in stem-differentiating xylem of Populus trichocarpa

发表期刊：Plant Physiology

发表时间：2022.8

了解基因表达和调控机制需要更加深入了解RNA转录、加工、修饰和翻译过程。然而，干旱胁迫下毛果杨（Populus trichocarpa）的表观转录组和蛋白质组之间的关系仍不确定。本研究利用DRS揭示了干旱处理下毛果杨次生木质部中RNA全长转录本的比率、m6A、poly(A)位点利用率和poly(A)长度的动态变化，同时将表观转录组和蛋白质组进行关联分析。

研究结果显示干旱胁迫下，全长转录本比率降低，转录组谱和蛋白质组谱之间的相关性下降，m6A比率增加，伴随着 mRNA和蛋白表达下降。有趣的是，干旱胁迫下大部分基因发生了近端poly(A)到远端poly(A)位点的转换。最后，研究者发现高表达基因的转录本具有较短的poly(A)尾，干旱胁迫增加了长poly(A)转录本的百分比。该研究进一步解析了干旱胁迫对于基因转录后调控的影响机制，为后续抗逆林木遗传材料的培育提供了理论指导。

文献解读详见：

文章题目：Comprehensive map of ribosomal 2'-O-methylation and C/D box snoRNAs in Drosophila melanogaster

发表期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：14.9

发表时间：2024.2

在核糖体RNA（rRNA）成熟过程中，会有多种修饰参与rRNA二级结构的正确折叠，从而影响核糖体的功能。rRNA的正确折叠及关键功能区域的2'-O-甲基化（Nm）和假尿苷（Ψ）修饰对其催化活性至关重要，且这些修饰主要由C/D box snoRNA及其相关蛋白复合体介导。C/D box snoRNA通过其反义元件（ASE）精确指导rRNA上的Nm添加。尽管许多生物体中已经发现Nm位点，但其与snoRNA的明确对应关系尚待全面解析。在本研究中，采用RiboMethSeq和DRS对黑腹果蝇的rRNA Nm位点进行了高分辨率的检测和量化，并构建了一个包含61个Nm位点的综合图谱，这些位点大多与106个表达的C/D box snoRNA相匹配。

其中探究了黑腹果蝇在面对不同环境应激的rRNA Nm修饰的变化情况。首先是暴露于氧化应激条件下的雄性果蝇，其rRNA的Nm修饰水平基本保持不变，仅有少数位点如28S rRNA的ψm3454表现出轻微的甲基化减少。而在营养缺乏条件下，尽管有些位点在营养缺乏组与对照组之间存在显著差异，但总体上Nm水平依旧保持稳定。最后是不同温度下的情况，发现果蝇的18个rRNA位点在不同温度下显示出差异性Nm甲基化。

文章题目：Sex-specific transcriptomic and epitranscriptomic signatures of PTSD-like fear acquisition

发表期刊：iScience

发表时间：2022.9

创伤后应激障碍（PTSD）的根源在于获得与特定创伤事件相关的记忆。已有临床研究表明PTSD病理生理学表现为大脑杏仁核对创伤相关或情绪线索的反应失调。RNA修饰可能影响RNA稳定、定位和剪切，并且能够动态可逆地调节翻译，以快速应对外部刺激。本研究通过对PTSD小鼠模型进行DRS及illumina cDNA测序，探究条件性恐惧应激反应过程中小鼠大脑杏仁核的转录变化。研究结果表明，PTSD创伤对小鼠杏仁核转录组的影响具有明显的性别二态性，并且在恐惧应激过程中，不同性别的转录响应存在显著差异。其次，RNA修饰中，尤其是m6A修饰主要富集在与神经递质调节和线粒体功能相关的转录本中，这些转录本也与PTSD密切相关。尽管具有修饰差异的转录本表达差异不明显，但是RNA修饰可能通过累积或者协同效应影响RNA代谢，对恐惧应激反应记忆的形成起早期调节作用。

文章题目：Nanopore sequencing unveils the complexity of the cold-activated murine brown adipose tissue transcriptome

发表期刊：iScience

发表时间：2023.8

可变转录（Alternative transcription）是一种转录后过程，通过转录起始位点变化、可变多聚腺苷酸化和可变剪切等过程从单个基因产生多个转录本，从而增加转录和翻译的复杂性。脂肪组织大致分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织，并且发挥不同的功能。在冷刺激下，棕色脂肪组织通过上调脂解作用来产生热量。已有研究表明，基因的差异表达影响细胞脂肪产热，此外RNA结合蛋白对差异转录利用（DTU）的调控也在脂肪细胞产热过程中发挥关键作用。

本研究将短读长的illumina测序及DRS长读长测序相结合，鉴定了在冷激活下小鼠棕色脂肪组织（BAT）中多个发生差异转录利用基因的isoforms。研究结果显示在冷刺激下，部分BAT基因出现显著的转录本转换，其中Cars2基因可从两个不同的启动子进行转录，形成具有不同结构和功能的转录本，进一步产生不同的编码蛋白，影响线粒体的呼吸，以响应冷刺激。

DRS是目前转录组研究领域最先进的测序技术之一，也是当前最先进的集transcript结构鉴定、RNA修饰（m5C、m6A、假尿苷等）检测和Poly(A)特征解析于一身的转录组测序技术，是发表高分文章的必备利器。

龙8总区基因作为国内最大的Nanopore测序服务商，已成功运用DRS技术完成了超过2000份样本的测序服务，涵盖人类细胞与肿瘤样品、动植物组织及细胞样本、真菌和病毒等广泛生物类型，在众多权威科学期刊上发表了高水平高影响力的学术文章。

参考文献：

Gao Y, Liu X, Jin Y, et al. Drought induces epitranscriptome and proteome changes in stem-differentiating xylem of Populus trichocarpa[J]. Plant Physiology, 2022, 190(1): 459-479.

Berthelier J, Furci L, Asai S, et al. Long-read direct RNA sequencing reveals epigenetic regulation of chimeric gene-transposon transcripts in Arabidopsis thaliana[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 3248.

Wu X, Su T, Zhang S, et al. N6-methyladenosine-mediated feedback regulation of abscisic acid perception via phase-separated ECT8 condensates in Arabidopsis[J]. Nature Plants, 2024: 1-14.

Reis A L M, Hammond J M, Stevanovski I, et al. Sex-specific transcriptomic and epitranscriptomic signatures of PTSD-like fear acquisition[J]. iScience, 2022, 25(9).

Engelhard C A, Khani S, Derdak S, et al. Nanopore sequencing unveils the complexity of the cold-activated murine brown adipose tissue transcriptome[J]. iScience, 2023, 26(8).

Sklias A, Cruciani S, Marchand V, et al. Comprehensive map of ribosomal 2′-O-methylation and C/D box snoRNAs in Drosophila melanogaster[J]. Nucleic Acids Research, 2024: gkae139.