随着生命科学领域的技术不断迭代升级，Direct RNA测序（DRS，直接RNA测序）已悄然成为研究者们研究复杂疾病病理机制的强大工具。Direct RNA测序凭借其直接读取全长转录本，无需反转录与PCR扩增的独特优势，可以真实反映细胞内RNA分子的原始状态，精准捕捉RNA单碱基水平上的各类化学修饰，如m6A、m5C和假尿苷等，这些修饰对于转录后调控具有重要意义，往往与疾病发生发展有着千丝万缕的联系。今天小编给大家分享Direct RNA测序在疾病相关研究中的应用，希望为大家带来DRS应用的新思路。

文章题目：Comprehensive gene profiling of the metabolic landscape of humanized livers in mice

发表期刊：Journal of Hepatology

影响因子：25.7

发表时间：2023.12.3

研究材料：构建人源化肝脏小鼠模型，分别对来自2个供体的人源化肝脏小鼠进行了禁食（Fast）和随意（AL）饮食干预；对来自供体1的样品进行3种关键的转录因子（PPARα，PPARγ，FXR）激动剂处理和对照样品（DMSO），每组样品3-4个生物学重复。

人类肝脏的生理反应和基因调控信息难以直接获取，因此，该类研究通常依赖于动物模型尤其是小鼠模型的数据。然而，人类与小鼠肝脏之间在基因调控层面存在显著差异，这对基于小鼠模型推断人类肝脏代谢途径动态响应的有效性构成了挑战。由于患者群体的遗传背景多样性和环境暴露因素复杂，通过病人群体研究直接揭示人类肝脏转录组动力学的整体图谱非常困难。因此，迫切需要一种不受个体差异影响的方法来系统地研究人类肝脏转录组对生理代谢刺激的响应。

图1 人源化肝脏的表观遗传学图谱

研究结果显示，DRS技术不仅能够在基因水平上捕捉到与传统短读长RNA-seq相似的转录本表达模式，而且在检测长非编码RNA、未注释的转录本异构体、RNA修饰（如m6A修饰）和poly(A)尾长度方面具有优势。研究者通过DRS分析发现了大量新的转录本异构体，尤其是在人类和小鼠肝脏中分别有超过一半（54.6%）和更多（70.8%）的转录本是现有参考注释中未包含的。此外，研究还鉴定了特定条件下表达的转录本，进一步证实了代谢刺激下人类肝脏转录组调控的复杂性，只有建立包含这些条件信息的完整注释才能准确解析相关调控机制。

综上所述，该研究通过创新性的技术和实验设计，提供了前所未有的关于人类肝脏代谢途径和转录组调控机制的详细图谱，这些发现将有助于更好地理解涉及疾病的基因功能，并助力临床精准定位和特定病理生理相关的代谢网络变化。同时，研究指出了利用DRS技术深入剖析复杂转录组对深入理解人类肝脏病理生理学理论知识具有重要价值。

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文章题目：SINEUP non-coding RNA activity depends on specific N6-methyladenosine nucleotides

发表期刊：Molecular Therapy Nucleic Acids

影响因子：10.183

发表时间：2023.4.7

研究材料：METTL3敲除细胞、Ctrl敲除细胞和正常IVT细胞

本研究揭示了SINEUP非编码RNA在增强靶向mRNA翻译活性方面对N6-甲基腺苷（m6A）修饰的依赖性。SINEUP是一类自然和人工合成的长链非编码RNA，其通过两个功能性区域发挥作用：嵌入式反向SINEB2元件作为效应域，以及提供靶标选择性的反义区域（结合域）。

该技术能特异性地增强目标mRNA与多聚核糖体复合物的结合，进而提升翻译效率，适用于遗传性疾病（如单基因缺乏症）及复杂疾病的治疗。旨在通过恢复病变基因及其补偿通路来恢复正常生理功能。

研究团队发现，天然来源的小鼠SINEUP AS Uchl1和人工合成的人类miniSINEUP-DJ-1均被METTL3酶进行了m6A修饰，并利用DRS技术和逆转录实验确定了m6A修饰位点在SINEUP序列上的分布。当去除SINEUP RNA中的m6A时，靶标mRNA与活跃翻译多聚核糖体的结合显著减少，导致该mRNA从活跃翻译组分中耗减，但不影响SINEUP RNA自身的富集。METTL3敲降的细胞中，SINEUP的活性显著降低，表现为DJ-1蛋白水平的下降，说明m6A修饰对于SINEUP功能至关重要。

研究证实了SINEUP非编码RNA的活性确实依赖于特定的m6A修饰，并且这种修饰对于SINEUP介导的目标mRNA与多聚核糖体复合物的结合以及翻译增强过程起着至关重要的作用。推测m6A修饰可能招募特定的m6A阅读器，促使靶标mRNA释放并与多聚核糖体结合进行翻译。这一发现对于理解SINEUP非编码RNA的独特作用机制具有重要意义，同时也为其作为治疗性RNA分子在应对众多医疗需求中的安全应用奠定了理论基础。通过深入研究m6A修饰与SINEUP活性的关系，有望在未来提升SINEUP技术在临床实践中的应用潜力。

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图2 SINEUP基因m6A修饰位点的鉴定

文章题目：TENT5 cytoplasmic noncanonical poly(A) polymerases regulate the innate immune response in animals

发表期刊：Science Advances

影响因子：14.957

发表时间：2022.11.16

研究材料：以野生型和tent-5突变体，大肠杆菌上生长和金黄色葡萄球菌感染8小时的秀丽隐杆线虫为材料进行RNA-seq。以秀丽隐杆线虫的野生型和tent-5突变体，小鼠原代巨噬细胞（BMDMs）的Tent5aFlox/Flox Tent5c−/−突变体和野生型为材料进行DRS测序。以秀丽隐杆线虫的野生型和tent-5突变体为材料进行蛋白质组学分析。

先天免疫作为宿主防御的第一道防线，具有普遍性和快速应答的特点。本研究通过Direct RNA测序和蛋白质组学分析，首次揭示了细胞质多聚腺苷酸化酶TENT-5能够增强秀丽隐杆线虫中分泌型先天免疫效应蛋白的表达。Direct RNA测序显示，在tent-5突变体的线虫中，含有信号肽编码序列的多个mRNA具有较短的Poly(A)尾。这些mRNA在内质网中翻译，而TENT-5在内质网中显示出活性，暗示这些mRNA可能是TENT-5直接影响的底物。TENT-5缺失使线虫对细菌感染更为敏感，表明TENT-5在先天免疫中的角色具有进化保守性。

综上所述，该研究不仅加深了对TENT-5这类新型调控因子如何通过调节mRNA多聚腺苷酸化来影响先天免疫效应蛋白表达的理解，还有助于扩大我们对动物先天免疫系统精密调控网络的认知框架。同时，这些发现也为将来研发针对感染性疾病以及其他与免疫相关的疾病的治疗方法提供了新的理论依据和潜在药物靶点。

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图3 tent-5突变体中下调的转录本是TENT-5多腺苷酸化的直接靶点

文章题目：Direct long-read RNA sequencing identifies a subset of questionable exitrons likely arising from reverse transcription artifacts

发表期刊：Genome Biology

影响因子：14.957

发表时间：2021.6.28

研究材料：耐药患者的肿瘤异种移植样本分别进行ONT direct RNA-seq和cDNA-seq，报告基因转染的细胞分别进行direct RNA-seq、direct cDNA-seq和illumina cDNA-seq

除其他因素外，淋巴细胞白血病对CD19介导的免疫疗法的耐药性，归因于CD19 pre-mRNA的几种可变剪接事件，包括CD19-ex2part。已知“exitron”存在于数百个人转录本中。

为了研究CD19-ex2part，作者用thapsigargin处理NALM-6 B-ALL细胞系，使用 RT-PCR检测。正如预期的那样，剪接的XBP1 isoform增加，但是CD19-ex2part产物无变化。这就对IRE1在外显子2剪切中的作用提出了质疑。接着，作者对耐药患者的肿瘤异种移植RNA样本分别进行ONT Direct RNA测序(dRNA-seq)和cDNA-seq分析。出乎意料的是，CD19-ex2part仅存在cDNA-seq中，而在dRNA-seq中完全没有。表明它可能是基于逆转录或PCR扩增的产物。CD19-ex2part序列分析显示，exitron可以折叠成一个稳定的发夹结构，两侧具有两个8nt的重复序列，暗示可能由RT-PCR延伸引起的。本研究作者使用报告基因检测和Direct RNA测序证实，CD19 exitron是逆转录的产物，并在公共数据集中检测到类似结果。该研究强调了dRNA-seq对isoform验证的重要性。

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图4 CD19-ex2part是逆转录产物

文章题目：Cytoplasmic poly(A)denylation by TENT5A is required for proper bone formation

发表期刊：Cell Reports

发表时间：2021.04

研究材料：WT(野生型）和Tent5a KO(Tent5a缺陷型)新生小鼠颅骨和成年小鼠长骨成骨细胞，体外培养14天取样进行Direct RNA测序。

I型胶原蛋白形成受阻导致人类疾病成骨不全症(OI)，成骨不全症的特征是骨骼异常，骨脆弱、频繁骨折，在某些情况下，身材矮小或变形。成骨细胞通过分泌I型胶原蛋白和羟基磷灰石晶体矿化基质的其他成分，来协调骨形成过程。

研究通过构建Tent5a基因敲除（Tent5a KO）小鼠模型，发现其表现出与OI类似的骨骼畸形，如多发性骨折。进一步研究表明，TENT5A特异性地调控胶原I、SerpinF1和Sparc等与骨骼健康密切相关的mRNA在胞质内的多腺苷酸化过程。Tent5a KO小鼠中这些mRNA的多腺苷酸尾巴显著缩短，导致胶原I的表达量和质量均受损，表现为血清中前胶原I水平显著降低，以及成骨细胞中胶原I 的mRNA表达量在矿化阶段显著下降。此外，成骨细胞中高丰度的胶原编码mRNA呈现长多腺苷酸尾巴，这与TENT5A在骨质基质生成中的重要作用一致，揭示了胞质多腺苷酸化在骨骼发育中独特的调控机制。本研究探讨了TENT5A缺失对成骨细胞功能和胶原合成的具体影响，为理解成骨不全症等疾病的发病机理提供了新的理论依据，并强调了胞质多腺苷酸化在骨骼生物学中的核心地位。

文献解读详情见：

图5 TENT5A负责细胞质多聚腺苷酸化，增加分泌蛋白的表达

DRS是目前转录组研究领域最先进的测序技术之一，也是当前最先进的集transcript结构鉴定、RNA修饰检测和Poly(A)特征解析于一身的转录组测序技术，是发表高分文章的必备利器。

龙8总区基因作为国内最大的Nanopore测序服务商，已成功运用DRS技术完成了超过2000份样本的测序服务，涵盖人类细胞与肿瘤样品、动植物组织及细胞样本、真菌和病毒等广泛生物类型，在众多权威科学期刊上发表了高水平高影响力的学术文章。

参考文献：

Jiang C, et al. Comprehensive gene profiling of the metabolic landscape of humanized livers in mice. J Hepatol. 2023. doi:10.1016/j.jhep.2023.11.020

Pierattini B, et al. SINEUP non-coding RNA activity depends on specific N6-methyladenosine nucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 2023. doi:10.1016/j.omtn.2023.04.002

Vladyslava L et al. ,TENT5 cytoplasmic noncanonical poly(A) polymerases regulate the innate immune response in animals. Science Advances. 2022. doi:10.1126/sciadv.add9468

Schulz, L., et al. Direct long-read RNA sequencing identifies a subset of questionable exitrons likely arising from reverse transcription artifacts. Genome Biology. 2021.

doi:10.1186/s13059-021-02411-1

Olga G, et al., Cytoplasmic polyadenylation by TENT5A is required for proper bone formation. Cell Reports. 2021. doi:10.1016/j.celrep.2021.109015