图S2 全基因组圈图
注：(A)为染色体，(B)-(F)为质粒。

使用qRT-PCR测定了替加环素抗性相关的外排泵基因(如acrA，acrB，ramA，marA，soxS和acrAB)的表达水平，表明KP58的替加环素抗性与AcrAB外排系统的过表达有关。还发现了无质粒载体的替加环素抗性基因tet(X)。虽然分离株对mcr基因呈阴性，但它携带了一种类似ISKpn26的元件插入到mgrB基因中，这是一种已知的赋予粘菌素抗性的插入。
还发现了三种潜在的毒力因子，包括对aerobactin, hypermucoviscosity（高粘液性）和 yersiniabactin（耶尔森菌素）的响应。KP58被确定为ST11型，这是一种广泛传播的多药耐药K. pneumoniae克隆系，在世界范围内造成严重感染。用Kaptive预测KP58的KL型(多糖胶囊和脂多糖O抗原)，为KL64。还鉴定了属于不相容(Inc) F组[IncFIB, IncR, 和 IncFII]和ColRNAI 4个质粒的复制子。

使用垂直遗传核心基因组SNPs和核心基因组MLST分析，以评估KP58与从中国收集的416株ST11 K. pneumoniae菌株之间的系统发育关系。系统发育树具有很高的多样性，最具地理相关的菌株被分组为相同的类群，其差异为<10个SNPs（图1）。大多数从四川和杭州收集的分离株，含有最高比例的已知的抗生素耐药决定因子。结果表明，与KP58关系最密切的菌株是L39_2的，另一种从杭州人粪便样品中分离的ST11菌株，这些菌株仅有10个cgMLST位点或9个SNPs(图2)。
在KP58质粒中，携带碳青霉烯类耐药基因bla_KPC-2的IncR/IncFII 质粒(134,972bp)，与中国成都分离的产生KPC-2的菌株wchkp020037的质粒pKPC2_020037具有99%的同源性和75%的覆盖率。发现pKP58-2的骨架区含有复制和稳定质粒的基因，但缺乏共轭基因。
质粒pKP58-2上bla_KPC-2的遗传背景由Tn3-tnpA，Tn3-tnpR，ISKpn27，Tn3-Δbla_TEM-1，bla_KPC-2，ΔISKpn6，korC，klcA，ΔrepB和ΔTn1721组成，几乎与三个质粒：p3_L39、p2b2和pKPC2_020037的组成相同。
另一个IncFII型质粒(87,095bp)含有耐药基因qnrs1、tet(A)、cata2、sul2和dfra14，已知它们分别对氟喹诺酮、四环素、酚类、磺胺类和甲氧苄啶具有耐药性。

此外，一组由iucABCD，iutA，rmpA和rmpA2组成的毒力基因均位于IncFIB/IncHI1B质粒(197,415bp)上，而在同一质粒中未检测到抗性基因。将这种毒力质粒命名为pKP58-1，并与NCBI GenBank数据库中的其他质粒进行比较，结果显示其与先前报道的三种毒力质粒具有同源性，包括pK2044（99%同源性和93%覆盖率）、pLVPK（99%同源性和89%覆盖率）和pVir-CR-HvKP4（99%同源性和78%覆盖率）。此外，pKP58-1的大小小于pK2044和pLVPK这两个质粒，但大于pVir-CR-HvKP4(178,154bp)（图3）。
 

结论
本研究使用Illumina和Nanopore平台对一株全耐药性的肺炎克雷伯菌KP58进行测序，通过混合基因组组装，可以获得高质量的全基因组序列，包括1个环状染色体和5个环状质粒。该菌株具有多种抗生素耐药性和毒力因子。对粘菌素的抗性与一个类似ISKpn26插入到mgrB基因中有关；对替加环素的抗性与AcrAB外排泵系统的过度表达有关。与KP58亲缘关系最近的是从杭州收集的另一种临床分离株，仅相差10个cgMLST位点。这些数据将为肺炎克雷伯菌感染的预防、诊断和治疗策略提供重要指导。

参考文献
Wick RR, Judd LM, Gorrie CL, Holt KE. Unicycler: resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Comput Biol. 2017;13(6):e1005595.
Wick, R.R., Judd, L.M., Gorrie, C.L. and Holt, K.E. Completing bacterial genome assemblies with multiplex MinION sequencing. Microb Genom. 2017;3(10):e000132.
Ruan Z, Wu J, Chen H, Draz MS, Xu J and He F. Hybrid Genome Assembly and Annotation of a Pandrug-Resistant Klebsiella pneumoniae Strain Using Nanopore and Illumina Sequencing. Infect Drug Resist. 2020;13:199-206.