你还在用MeRIP-seq鉴定m6A修饰吗？你还在用100nt分辨率的m6A检测手段吗？你已经out了！龙8总区基因重磅推出RNA甲基化研究新技术——Direct RNA测序——高准确性、单碱基分辨率、全方位RNA修饰信息检测开启m6A修饰检测新纪元！

Direct RNA测序性能远超MeRIP-seq，RNA甲基化研究正式进入单碱基直接测序时代！！！

1、单碱基水平的甲基化修饰（同时检测m6A，m5C、假尿苷.......等一百余种RNA修饰）；

2、交付周期快，重复性好（直接测RNA，不需要抗体富集，实验操作简单，实验时间缩短至MeRlP-seq的三分之一）；

3、价格相当（RNA004价格大幅下降）。

图1 Direct RNA测序和MeRIP-seq的方法比较

MeRIP-seq只能鉴定在100-200nt的reads上含有m6A修饰，而Direct RNA测序可以鉴定不同的转录本上单碱基水平的m6A，m5C，假尿苷修饰。

为什么MeRIP-seq和Direct RNA测序会存在如此大的差异呢？这是由于两者的测序原理造成的。

通过特异识别m6A修饰的抗体，对具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，对沉淀下来的RNA片段进行高通量测序。具体过程包括：RNA分子首先被片段化成约100-200nt的片段，通过抗体富集含有m6A修饰的RNA片段，然后进行二代转录组建库测序，作为IP样本反映该RNA片段上含有m6A修饰。同时，所有的RNA片段均会进行常规二代转录组建库测序，作为Input对照样本反映基础RNA的丰度。分析时，将IP样品和Input对照样品数据结合获得m6A peak峰。

基于Nanopore测序平台，原始RNA分子在电压差的作用下可以按照3’端到5’端方向穿过纳米孔，并将穿孔时的电流信号变化解码为相应的碱基信息和修饰信息。分析时，一条reads即为一条转录本的原始序列，因而可以全面表征RNA的各种异构体、剪接变体、融合转录本、3’端多腺苷酸化、Poly(A)尾长等结构特征及其甲基化修饰情况。

1. Direct RNA测序预测的m6A修饰位点可以很好地被MeRIP-seq和m6A-REF-seq验证。Direct RNA测序预测的m6A修饰基因有81%（2626/3253）被MeRIP-seq检测到，预测m6A位点有49%被MeRIP-seq peak覆盖。且Direct RNA测序预测的m6A位点有80%被m6A-REF-seq验证到（图2）。

图2 用MeRIP-seq and m6A-REF-seq/MAZTER-seq验证Direct RNA测序的结果[1]

2. Direct RNA测序可以鉴定到单个m6A位点，而MeRIP-seq的m6A 修饰分辨率只有100-200nt。基于Direct RNA测序和MeRIP-seq 共同鉴定到的lncRNA中，Direct RNA测序鉴定到220个m6A修饰位点，而MeRIP-seq仅鉴定到33个m6A peaks，这意味着通过MeRIP-seq检测到的每个m6A峰平均对应6至7个m6A修饰位点（表1）。

3. Direct RNA测序可以分析m6A修饰频率（每个分子中平均m6A出现的间隔）。m6A修饰频率最高的基因，约49-88 nt一个m6A；修饰频率最低的基因，约445-261nt 一个m6A修饰（表1）。

表1 通过MeRIP-seq和Direct RNA测序（dRNA-seq）鉴定的m6A修饰的lncRNA列表[2]

4. Direct RNA测序可以鉴定全长转录本上的m6A修饰位点。MeRIP-seq仅在3’端鉴定到m6A peaks，5’端几乎没有。而Direct RNA测序在3’端和5’端均鉴定到m6A位点（图3）。

图3 通过（a）MeRIP-seq和（b）Direct RNA测序（dRNA-seq）检测到的NEAT1 m6A修饰和reads分布[2]

5. Direct RNA测序能在单碱基水平、转录本水平鉴定m6A修饰。而MeRIP-seq只能获得基因水平的m6A peak峰（图4）。

图4 腺病毒isoform特异性的m6A检测结果[3]

[1] Gao Y, Liu X, Wu B, Wang H, Xi F, Kohnen MV, Reddy ASN, Gu L. Quantitative profiling of N6-methyladenosine at single-base resolution in stem-differentiating xylem of Populus trichocarpa using Nanopore direct RNA sequencing. Genome Biol. 2021 Jan 7;22(1):22. doi: 10.1186/s13059-020-02241-7.

[2] Krusnauskas R, Stakaitis R, Steponaitis G, Almstrup K, Vaitkiene P. Identification and comparison of m6A modifications in glioblastoma non-coding RNAs with MeRIP-seq and Nanopore dRNA-seq. Epigenetics. 2023 Dec;18(1):2163365. doi: 10.1080/15592294.2022.2163365. Epub 2023 Jan 3.

[3] Price AM, Hayer KE, McIntyre ABR, Gokhale NS, Abebe JS, Della Fera AN, Mason CE, Horner SM, Wilson AC, Depledge DP, Weitzman MD. Direct RNA sequencing reveals m6A modifications on adenovirus RNA are necessary for efficient splicing. Nat Commun. 2020 Nov 26;11(1):6016. doi: 10.1038/s41467-020-19787-6.